प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी जिसमें उत्कृष्ट विभेदन (super-resolution) प्राप्त करनें के लिए प्रकाशसक्रियक परीक्षित्र की आवश्यकता होती है

Key Points

• उत्कृष्ट-विभेदन सूक्ष्मदर्शीता (SRM) उन्नत सूक्ष्मदर्शीता तकनीक है जो पारंपरिक सूक्ष्मदर्शीता की तुलना में उच्च विभेदन प्राप्त करती है।
• प्रकाश के विवर्तन के कारण पारंपरिक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी की विभेदन सीमा लगभग 200nm है।
• SRM पारंपरिक सूक्ष्मदर्शीता की तुलना में 20 गुना अधिक विभेदन प्राप्त कर सकता है।
• एबे (1873) ने उस स्थान की त्रिज्या को, जहाँ प्रकाश विवर्तित होता है, विवर्तन सीमा के रूप में परिभाषित किया है।
• एबे की विवर्तन सीमा प्रकाश तरंगदैर्घ्य, माध्यम के अपवर्तनांक और अभिसारी बिन्दु के अर्धकोण पर निर्भर करती है।
• संख्यात्मक एपर्चर (NA) एक सीमित कारक है , और आज के शीर्ष प्रकाशिकी में अधिकतम लगभग 1.4 NA है, जिसके परिणामस्वरूप λ/2NA, या 0.25 μ मीटर (500 NAम पर हरे प्रकाश के लिए) (200 NAम पार्श्व / 500 NAम अक्षीय) की एबे सीमा होती है। यह विभेदन कोशिकाओं के अंदर दो अलग-अलग घटकों और अणुओं के बीच अंतर करने के लिए काफी उच्च है।
• इससे समाधान पर एक सीमा उत्पन्न होती है।
• प्रकाश की विवर्तन सीमा को पार करने के लिए, वैज्ञानिक उत्कृष्ट-विभेदन सूक्ष्मदर्शीता (SRM) का उपयोग करते हैं जो पूरे ऑर्गेनेल और व्यक्तिगत प्रोटीन सहित नैनोस्केल पैमाने पर कोशिकीय संरचनाओं का अध्ययन करने में मदद करता है।
• उत्कृष्ट-विभेदन सूक्ष्मदर्शीता तकनीकों को उनके अंतर्निहित अधिकतम टेम्पोरल विभेदन और पार्श्व/अक्षीय विभेदन के आधार पर मोटे तौर पर दो समूहों में विभाजित किया जा सकता है।
  • उत्तेजित उत्सर्जन ह्रास (STED) और संरचित प्रदीप्ति सूक्ष्मदर्शीता (SIM) पैटर्नयुक्त प्रकाश प्रदीप्ति तकनीकों के दो उदाहरण हैं, जहां दृष्टिकोण बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन को नियंत्रित करके उत्तेजित प्रकाश पैटर्न को संशोधित करके फोकल स्पॉट आकार को कम करना है।
  • दूसरी श्रेणी एकल अणु स्थानीयकरण-आधारित तकनीक है जिसमें STORM (प्रसंभाव्य ध्रुवण पुननिर्माण सूक्ष्मदर्शीता) और PALM (फोटो-एक्टिवेशन लोकलाइजेशन सूक्ष्मदर्शीता) शामिल हैं। विवर्तन अवरोध को दूर करने के लिए इस दृष्टिकोण में, फोटोस्विचेबल या फोटोएक्टिवेटेबल फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग किया जाता है।

स्पष्टीकरण:

विकल्प 1: संरचित प्रदीप्ति सूक्षमदर्शी (SIM)

• SIM का सिद्धांत मोइरे प्रभाव पैदा करने के लिए हस्तक्षेप प्रकाश पैटर्न उत्पन्न करने हेतु नमूने के उत्तेजना पर आधारित है।
• छवियों को विवर्तन सीमा से लगभग दो गुना अधिक विभेदन पर समझा जाता है।
• फोटोस्टेबल रंगों का उपयोग गुणवत्तापूर्ण चित्र बनाने के लिए किया जाता है।
• जबकि जीवित कोशिकाओं को देखने के लिए कार्बनिक रंगों के अतिरिक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन का भी आमतौर पर उपयोग किया जाता है।
• अन्य SRM तकनीकों की तुलना में सिम का लाभ यह है कि इसका उपयोग मोटे भागों की इमेजिंग के लिए किया जा सकता है।
• इस तकनीक में फोटोएक्टिवेटेबल जांच का उपयोग नहीं किया जाता है।
• इसलिए, यह एक गलत विकल्प है।

विकल्प 2: dSTORM - प्रसंभाव्य पुनर्निर्माण सूक्ष्मदर्शीता

• प्रसंभाव्य ध्रुवण पुनर्निर्माण सूक्ष्मदर्शीता एकल-अणु प्रतिदीप्ति संकेत के प्रसंभाव्य स्विचिंग पर आधारित है।
• STORM में, विवर्तन अवरोध को फोटोएक्टिवेटेबल या फोटोस्विचेबल जांच का उपयोग करके दूर किया जाता है जो फ्लोरोसेंट (प्रकाश) और अंधेरे अवस्थाओं के बीच संक्रमण करते हैं।
• अतः यह सही उत्तर है।

विकल्प 3: उत्तेजित उत्सर्जन ह्रास सूक्ष्मदर्शीता

• उत्तेजित उत्सर्जन ह्रास सूक्ष्मदर्शीता (STED) की व्यवस्था लेजर अवलोकन संनाभि सूक्ष्मदर्शी के समान है।
• LSCM में, छवि बनाने के लिए एक एकल लेजर का उपयोग किया जाता है, जबकि STED में फोकल प्लेन पर दो लेजर का उपयोग किया जाता है। पहला लेजर जिसे उत्तेजक लेजर कहा जाता है, फ्लोरोफोर को उत्तेजित करता है जबकि दूसरा लेजर जिसे STED लेजर कहा जाता है, उत्तेजित अवस्था वाले फ्लोरोफोर को दबा देता है जो उत्तेजना फोकल बिंदु के पास स्थित होता है। दमन की इस प्रक्रिया को उत्तेजित उत्सर्जन कहा जाता है।
• दोनों लेज़र मिलकर बिंदु प्रसार कार्य को कम करते हैं जिससे विभेदन बढ़ जाता है।
• इसलिए, चित्र प्राप्ति के दौरान, मानक उत्तेजन लेजर पल्स के तुरंत बाद एक लम्बी तरंगदैर्घ्य वाली डोनट के आकार की पल्स आती है, जिसे STED बीम के रूप में जाना जाता है।
• इसलिए, यह एक गलत विकल्प है।

विकल्प 4 : लेजर अवलोकन संनाभि सूक्ष्मदर्शी

• लेजर अवलोकन संनाभि सूक्ष्मदर्शी (LSCM) संनाभि सूक्ष्मदर्शीता का एक प्रकार है।
• जब लेज़र प्रकाश को नमूने के एक छोटे से स्थान पर केंद्रित किया जाता है तो फ्लोरोफोर उत्तेजित हो जाते हैं और प्रतिदीप्ति उत्सर्जित करते हैं। प्रतिदीप्ति की प्रकाश तीव्रता बिंदु-प्रसार फ़ंक्शन और छवि द्वारा विभेदन की सीमाओं द्वारा निर्धारित की जाती है। डिटेक्टर प्रतिदीप्ति प्रकाश को इकट्ठा करते हैं जिसे एकल पिक्सेल के रूप में आउटपुट किया जाता है।
• इसमें क्षेत्र की गहराई को नियंत्रित करने की क्षमता है, जिससे मोटे नमूनों से शृंखलाबद्ध खंड एकत्रित किए जा सकते हैं।
• फ्लोरोफोरस LSCM का एक आवश्यक घटक है लेकिन वे फोटोएक्टिवेटेड फ्लोरोफोरस नहीं हैं।
• इसलिए, यह एक गलत उत्तर है।

अतः सही उत्तर विकल्प 2 अर्थात dSTORM - प्रसंभाव्य ध्रुवण पुनर्निर्माण सूक्ष्मदर्शीता है।